Cambiasso bắt đầu chơi cho đội tuyển Argentina từ các đội trẻ, cùng những đồng đội như Juan Román Riquelme, Pablo Aimar, Wálter Samuel và một số cầu thủ khác. Anh tham dự giải Trẻ Thế giới vào năm 1997, giải đấu mà anh ghi bàn đầu tiên ở trận chung kết dù cho anh là người trẻ nhất, và sau đó anh đeo băng đội trưởng vào năm 1999.

Cambiasso có trận ra mắt cho đội tuyển quốc gia Argentina vào năm 2000. Vào ngày 15 tháng 5 năm 2006, anh được triệu tập vào đội tuyển Argentina ở World Cup 2006, và vào ngày 16 tháng 6, anh kết thúc 24 đường chuyển của các cầu thủ Argentina sau khi ghi bàn trong trận gặp Serbia và Montenegro. Ở trận tứ kết gặp Đức vào ngày 30 tháng 6 năm 2006, khi trận đấu bước vào loạt luân lưu, nơi cú đá của Cambiasso bị cản phá và đó cũng là quả đá quyết định dẫn tới trận thua 2-4 của Argentina và Đức được vào bán kết.

Kể từ khi Diego Maradona lên nắm quyền ở đội tuyển Argentina, Cambiasso chưa được triệu tập vào đội tuyển dù cho vẫn đang giữ một vị trí quan trọng tại Inter và được đánh giá là một trong những tiền vệ hay nhất châu Âu.

Sau Cúp bóng đá Nam Mỹ 2011 đáng thất vọng của đội tuyển Argentina (thất bại trước Uruguay trên chấm 11m), Cambiasso quyết định chia tay đội tuyển Argentina sau 11 năm gắn bó, tổng cộng anh đã 52 lần ra sân và ghi được 5 bàn thắng.